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層析技術(shù)的應用與發(fā)展，對于植物各類(lèi)化學(xué)成分的分離鑒定工作起到重大的推動(dòng)作用。如中藥丹參的化學(xué)成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱(chēng)為丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后進(jìn)一步的研究，發(fā)現除丹參酮Ⅰ為純品外，Ⅱ、Ⅲ、均為混合結晶。此后通過(guò)各種層析方法，迄今已發(fā)現15種單體（其中有4種為我國發(fā)現）。新的層析技術(shù)不斷發(fā)展，隨著(zhù)層析理論和電子學(xué)、光學(xué)、計算機等技術(shù)的應用，層析技術(shù)已日趨完善。

　　一、層析法的基本原理： 層析過(guò)程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相"溶劑之間的分配系數之差（分配層析），組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大?。ㄅ抛鑼游觯┒蛛x。通常又將一般的以流動(dòng)相為氣體的稱(chēng)為氣相層析，流動(dòng)相為液體的稱(chēng)為液相層析。

　　一、吸附層析法（AdsorptionChromatography）

　?。ㄒ唬┪絼?、溶劑與被分離物性質(zhì)的關(guān)系：液一固吸附層析是運用較多的方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)三因素。

　　1. 吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。

　?。?） 硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結構，同時(shí)在顆

　　粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過(guò)氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著(zhù)的水分增加而降低。若吸水量超過(guò)17％，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化，當硅膠加熱至100～110℃時(shí)，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當溫度升高至500℃時(shí)，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進(jìn)行（一般在170cC以上即有少量結合水失去）。

　　硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當遇到較強的堿注化臺物，則可因離子交換反應而吸附堿性化合物。

　?。?）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類(lèi)的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內酯等類(lèi)型的化合物分離。因為有時(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級反應，如異構化、氧化、消除反應等。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性，稱(chēng)為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱(chēng)為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內徑與柱長(cháng)比例在1：10-20之向。

　　在用溶劑沖洗柱時(shí)，流速不宜過(guò)快，洗脫液的流速一般以每半～1小時(shí)內流出液體的毫升數與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。

　?。?）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，選用顆?；钭⑻?，若為活性炭細粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕矣诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類(lèi)及某些甙?；钚蕴康挠袨槲阶饔?，在水溶液中zui強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力zui弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開(kāi)，單糖與多糖分開(kāi)，氨基酸與多肽分開(kāi)。

　　2.溶劑：層析過(guò)程中溶劑的選擇，對組分分離關(guān)系極大。在柱層析時(shí)所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習慣上稱(chēng)洗脫劑，用于薄層或紙層析時(shí)常稱(chēng)展開(kāi)劑。洗脫劑的選擇，須根據被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結合起來(lái)加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時(shí)，當被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。

　　在柱層操作時(shí)，被分離樣品在加樣時(shí)可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個(gè)十分緩慢的過(guò)程，稱(chēng)為“梯度洗脫"，使吸附在層析柱上的各個(gè)成分逐個(gè)被洗脫。如果極性增大過(guò)訣（梯度太大），就不能獲得滿(mǎn)意的分離。溶劑的洗脫能力，有時(shí)可以用溶劑的介電常數（ε）來(lái)表示。介電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。

　　3.被分離物質(zhì)的性質(zhì)：被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個(gè)要素，彼此緊密相連。在的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個(gè)成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結構與性質(zhì)有關(guān)。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。

　　當然，中草藥成分的整體分子觀(guān)是重要的，例如極性基團的數目愈多，被吸附的住能就會(huì )大些，在同系物中碳原子數目少些，被吸附也會(huì )強些?？傊?，只要兩個(gè)成分在結構上存在差別，就有可能分離，關(guān)鍵在于條件的選擇。要根據被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強度，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來(lái)考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般Ⅲ～Ⅳ級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統中的分離情況。此外，能否獲得滿(mǎn)意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系?，F以實(shí)例說(shuō)明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類(lèi)、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅膠為吸附劑時(shí)，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進(jìn)行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。

　　又如對于C-27甾體皂甙元類(lèi)成分，能因其分字中羥基數目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進(jìn)行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來(lái)。這一例子說(shuō)明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時(shí)，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果，從而說(shuō)明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系。

　?。ǘ┎緦訉游觯罕訉游鍪且环N簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進(jìn)行層析時(shí)一即稱(chēng)薄層層析。其原理與柱層析基本相似。

　　1.薄層層析的特點(diǎn)：薄層層析在應用與操作方面的特點(diǎn)與柱層析的比較。

　　2.吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細，一般應小于250目，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過(guò)高，以Ⅱ～Ⅲ級為宜。而展開(kāi)距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開(kāi)距離相應縮短，一般不超過(guò)10厘米，否則可引起色譜擴散影響分離效果。

　　3.展開(kāi)劑的選擇：薄層層析，當吸附劑活度為一定值時(shí)（如Ⅱ或Ⅲ級），對多組分的樣品能否獲得滿(mǎn)意的分離，決定于展開(kāi)劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而無(wú)極性、弱極性、中極性與強極性。但在實(shí)際工作中，經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小，對展開(kāi)劑的極性予以調整。 4·特殊薄層：針對某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，有時(shí)需采用一些特殊薄層。

　?、?熒光薄層：有些化合物本身無(wú)色，在紫外燈下也不顯熒光，又無(wú)適當的顯色劑時(shí)，則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無(wú)機物。其一是在 254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激潔的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬。

　?、?絡(luò )合薄層：常用的有硝酸銀薄層，用來(lái)分離碳原子數相等而其中C一C雙鍵數目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡(luò )合物，而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡(luò )合。因此在硝酸銀薄層上，化臺物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附zui弱而Rfzui高，含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高，含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。此外，在一個(gè)雙鍵化臺物中，順式的與硝酸銀絡(luò )合較反式的易于進(jìn)行。因此，還可用來(lái)分離順?lè )串悩嬻w。

　?、?酸堿薄層和PH緩沖薄層：為了改變吸附劑原來(lái)的酸堿性，可在鋪制薄層時(shí)采用稀酸或稀堿以代替水調制薄層。例如硅膠帶微酸性，有時(shí)對堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時(shí)，用稀堿溶液0.1～0.5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時(shí)，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）為展開(kāi)劑Rf＜0.1，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開(kāi)劑，Rf值增至0.4左右。說(shuō)明豬屎豆堿為——堿性生物堿。 5.應用：薄層層析法在中草藥化學(xué)成分的研究中，主要應用于化學(xué)成分的預試、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件。

　　用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預試，可依據各類(lèi)成分性質(zhì)及熟知的條件，有針對性地進(jìn)行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預試結果更為可靠。

　　以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定，要有標準樣品進(jìn)行共薄層層析。如用數種溶劑展層后，標準品和鑒定品的Rf值、斑點(diǎn)形狀顏色都*相同，則可作初步結論是同一化合物。但一般需進(jìn)行化學(xué)反應或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對。

　　用薄層層析法探索柱層分離條件，是實(shí)驗室的常規方法。在進(jìn)行柱層分離時(shí)，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過(guò)程中各個(gè)成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗。通過(guò)薄層的預分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對含量。如在薄層上摸索到比較滿(mǎn)意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分離條件經(jīng)適當改變，轉至一般往層所采用洗脫的方式進(jìn)行制備柱分離。利用薄層的預分離尋找柱層的洗脫條件時(shí)，假定在薄層上所測得的Rf值一樣品在柱層中的比移率（R）。這是由于在薄層展開(kāi)時(shí)，薄層固定相中所含的溶劑經(jīng)過(guò)不斷的蒸發(fā)，而使薄層上各點(diǎn)位置所含的溶劑量是不等的，靠近起始線(xiàn)的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴格控制層析操作條件，則可得到接近真實(shí)的Rf值。用薄層進(jìn)行某一組分的分離，其Rf值范圍，一般情形下為0.85＞Rf＞0.05.此外，薄層層析法亦應用于中草藥品種、藥材及其制劑真偽的檢查、質(zhì)量控制和資源調查，對控制化學(xué)反應的進(jìn)程，反應副產(chǎn)品產(chǎn)物的檢查，中間體分析，化學(xué)藥品及制劑雜質(zhì)的檢查，臨床和生化檢驗以及毒物分析等，都是有效的手段。